脊髓（suǐ）性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种（zhǒng）常染色（sè）体隐性遗传病，居儿童致（zhì）死（sǐ）性常染色体隐（yǐn）性遗传病的第2位。位于（yú）染色（sè）体5q11.2～q13.3上的运动神（shén）经元存活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是（shì）SMA的主要致病（bìng）基因。

　　人基（jī）因组有两个紧邻的高（gāo）度同（tóng）源的SMN基（jī）因：端（duān）粒侧的（de）SMN1和着（zhe）丝粒侧的SMN2，两者仅有5个碱基不同。SMN1是主要功能基因，该基因突变可导致（zhì）SMA发病，SMN2为临床（chuáng）表型的调节基因，影响病情的严重程（chéng）度，其拷（kǎo）贝数增加可（kě）减（jiǎn）轻SMA表型。目（mù）前已知约（yuē）94％的SMA患者为（wéi）SMN1基因第7和（或（huò））第8外显子纯合缺失所致，少数病（bìng）例（lì）可由SMN1基（jī）因点突变或小的（de）缺（quē）失引（yǐn）起（qǐ）。

　　SMN1基因外显子（zǐ）缺失（shī）检测的意义（yì）

　　SMA在人群中的发（fā）病率为1/5000～1/10000，群（qún）体（tǐ）携带者频率为1/35～1/50，是（shì）出生缺陷的高危因素，因此极有必要进行SMA携带者（zhě）的人群（qún）筛查，并通过（guò）产前诊断技（jì）术降（jiàng）低人群中SMA患儿的出生率。

　　临床上将SMA分（fèn）为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型、中（zhōng）间（jiān）型（xíng）和少年型，严重程度依次递减。神（shén）经专科医生一（yī）般（bān）根据（jù）患者发病年龄、临（lín）床（chuáng）表（biǎo）现（xiàn）及病情进展程度进行临床（chuáng）诊断（duàn），辅（fǔ）助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉（ròu）活检，结（jié）合家族史和SMN1基因分（fèn）析可进行确诊。由于SMA患（huàn）儿中约94%为SMN1基因外显子纯合缺失，因（yīn）此，SMN1基因缺失检测对于SMA的诊断具有更（gèng）高的（de）灵（líng）敏度和（hé）特异性（xìng）。且对（duì）不同（tóng）型的（de）SMA患者，SMN1纯合缺失率（lǜ）没有显著差异，所以，SMN1纯合缺失的检测对（duì）于不同型SMA患者具有（yǒu）相同的临（lín）床诊断价值。在欧美人（rén）群中（zhōng），SMN1基（jī）因纯合缺失检测已成为诊断和排（pái）除诊断SMA的首（shǒu）选方（fāng）法。

　　SMN1基因缺失检测（cè）试（shì）剂的现状

　　目前，SMN1基因（yīn）外显子缺（quē）失检测（cè）试剂较为（wéi）缺乏（fá），临床检验实（shí）验室较（jiào）为公认的方法是PCR结（jié）合（hé）限（xiàn）制性片段（duàn）长度多态性（PCR-RFLP）的方法。但（dàn）该方（fāng）法操作较为繁琐，且（qiě）重复性（xìng）差，不利于标准化（huà），不易推广。同时（shí），这种方法只能检测出（chū）纯合缺失，无（wú）法确认杂合缺失。

　　荷兰的SMAMLPA检测试剂可对待测靶序列进行半（bàn）定量分（fèn）析，因此既（jì）可检（jiǎn）测纯合缺失，亦可确（què）认杂合缺失。在国内（nèi）外已有多篇文献（xiàn）报（bào）道（dào）采用该方（fāng）法进行（háng）SMA患者诊断和SMA携带（dài）者筛查。但该产品目前仍为“仅（jǐn）用于（yú）研究”的试（shì）剂，尚未按照体外诊（zhěn）断类医疗器械（xiè）上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国家食品药品监管总局批准了第一项SMN1缺失突变（biàn）检测试剂上市。该（gāi）产品采用多重实（shí）时荧光MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因组单（dān）拷贝基因RPP40为（wéi）内参基因，对SMN1基因第7外显子（zǐ）和第8外显子拷贝数进行相对定（dìng）量检测，用于（yú）SMA患者（zhě）的体外辅助分子（zǐ）诊断。SMN1基因外显子缺失检测的难点之一在于排除高同源性基因SMN2的干扰，特别是对（duì）于SMN2高拷贝数的受试者，需保证结果的准确（què）可靠。该产品通过对实时荧光PCR相对（duì）定量、绝对定（dìng）量技术进行系统（tǒng）整合，并在反应体系中加入特定化学组分，以（yǐ）抑制（zhì）PCR引（yǐn）物3’端的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的错配，增加PCR扩增的特异性，从而有（yǒu）效控制SMN2基因非特异性扩增（zēng）对检（jiǎn）测结果（guǒ）的影响，准确检出（chū）高拷（kǎo）贝数SMN2样本中SMN1基因（yīn）第7和（hé）第8外显子（zǐ）的缺失情况。

　　鉴于国内外尚无任何（hé）按照体（tǐ）外诊（zhěn）断试剂（jì）批准上市的SMA分子诊断产品，因（yīn）此临床试验方（fāng）案中依据（jù）EMQN关于《SMA分（fèn）子诊断最佳实践指南（nán）》，采用了国内外（wài）SMA体外（wài）辅助分（fèn）子（zǐ）诊（zhěn）断领域公认的（de）PCR-RFLP法作为对照（zhào）方（fāng）法。临（lín）床（chuáng）试验共完成1069例，其中正常对照组777例，SMA病（bìng）例（lì）组292例，统计分析结果显示申报（bào）产品（pǐn）与对比（bǐ）方法检测结（jié）果的一致性为（wéi）100%（95%置信区（qū）间：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年人大样本中目标（biāo）外显子△△Ct分布范（fàn）围的调查亦显示，该产品的纯合突变判断界（jiè）值设置合理。

　　该（gāi）试剂目前批准的预期用（yòng）途仅包含纯合缺失的（de）检测，尚不能（néng）用于杂合缺失的检测（cè），因此无法用于SMA携（xié）带者的筛查，这是该产品的缺（quē）陷（xiàn）之一。

　　事（shì）实上（shàng），该产品在设计上已考（kǎo）虑到（dào）SMA携带者的检测（cè），其（qí）检（jiǎn）测（cè）原理是以待测样本中目标外显子荧光信号Ct值与内参（cān）基因（yīn）荧（yíng）光信（xìn）号（hào）Ct值之差（△Ct_s），与正常对照（zhào）品（pǐn）三个梯（tī）度（dù）稀释（shì）品（pǐn）中目标外（wài）显子荧光信号Ct值和内参基因荧光信号（hào）Ct值（zhí）之差的平均值（△Ct_a）之差，即△△Ct，作为待测（cè）样本中目标（biāo）外显子（zǐ）拷贝数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根（gēn）据实（shí）时荧光定量PCR相对定量的基本数（shù）学原理推导得（dé）到申报产品检测变量△△Ct的计（jì）算（suàn）公式，依（yī）据（jù）这一计算公式（shì）可推导出纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct理（lǐ）论值（或（huò）范围）；再结合（hé）目标外（wài）显子与内参基因扩增效率差异以及（jí）SMN2不同（tóng）拷贝数的影响（xiǎng），可对上述（shù）△△Ct理论值进行优化。结果显示纯合缺失、杂合缺（quē）失和野生型的（de）△△Ct值（或（huò）范围）之间可设置（zhì）合理的判断界值，因此理论上该产品可分（fèn）别检（jiǎn）测（cè）出三种基因状态（tài）。但鉴于生产企业对杂合缺失与野生（shēng）型之间的判断界值研究（jiū）尚（shàng）不透彻，再加上（shàng）缺乏可判定杂合缺失的对比方（fāng）法（fǎ）等其他（tā）困难，本次注册（cè）申（shēn）请（qǐng）的预期用途（tú）仅限于检测纯合突变，即（jí）SMA患者辅助诊（zhěn）断。

　　综上，SMN1基因外显子缺失检（jiǎn）测在（zài）SMA疾病诊断和SMA携（xié）带者筛查中具有重要的（de）临床价值。然（rán）而到（dào）目前（qián）为止，受到技术水平的（de）限制，相（xiàng）关的体外诊断试（shì）剂比较缺乏，特别是可用于SMA携带者筛（shāi）查（chá）的杂合（hé）缺失（shī）检测，尚无（wú）适合的体外诊断试剂上市。（器审（shěn）中心审评（píng）六部  何静（jìng）云）

来源（yuán）：中国医药报